多功能调制叶绿素荧光仪

搭载多波长激发光源，调制模式具备完整的PAM功能，可测量PSⅡ功能性捕光截面Sigma(Ⅱ)

非调制泵浦探针技术，可监测OEC状态与衰减，周期-4-震荡，类胡萝卜素三重态能量弛豫

重要升级：

Ø  一台仪器两种功能：非调制超快闪光动力学分析和多激发波长调制(PAM)应用。新款MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ是一款紧凑型仪器，同时包含两种截然不同的技术：单翻转闪光动力学(STK)和PAM技术。

Ø  超快时间分辨率：一套完整的快速测量组合(时间分辨率低至0.3μs)，可以探测PSⅡ供体侧放氧复合体Period-4震荡和类胡萝卜素三重态(Car-trip)的生成与能量弛豫，

Ø  多激发波长调制(PAM) 测量应用，可以探测PSⅡ受体侧、电子传递链和光合作用光化学活性。

Ø  两种技术组合使用：例如使用3 µs饱和闪光，通过PAM测量光监测诱导荧光信号的衰减动力学。测量光频率按对数递减。

全新功能：

Ø  高时间分辨率：新的STK探测器提供0.3 μs的时间分辨率。

Ø  时间分辨闪光响应：MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ是第一款市售仪器，可以测量饱和 μs 闪光期间的荧光产量，并可以区分类胡萝卜素三重态淬灭(TQ)和供体侧依赖性淬灭(DQ)。

Ø  高精度：为了详细分析闪光响应，它们的时间非常精确且可重现，闪光的形状接近矩形，LED需要大约0.5μs才能达到wan quan强度。为闪光配置文件校正提供了一个特殊的例程。

Ø  Ji强的闪光：使用EDST发射器检测器单元可以实现超过1000000 μmol 440 nm m-2 s-1的闪光强度(每μs产生超过1个激发)。

Ø  泵浦探针：具有可变暗间隔 ∆t(从1μs到10ms)的双闪实验，允许对各种形式的淬灭进行高度灵活的弛豫测量。

Ø  周期4振荡：高达100Hz(10ms间隔)的闪光频率可用于闪光序列，以探测放氧复合物的S状态。

Ø  叶片测量：虽然该仪器最初是为悬浮液测量而设计的，但EDST发射器检测器(STK-flashlamp)装置也可以单独用于测量植物叶片。此外，即将推出一种配置，其中两个发射器相对于多波长发射器呈45° 角放置，这允许对叶片发出的荧光进行两种波长的检测。

Ø  PAM记录中嵌入的STK：由于在快速非调制和PAM测量之间快速切换[8-10μs切换时间]，ST可以放置在传统测量中的任何位置，例如O-I1-I 2-P或慢速动力学记录，所得STK揭示了闪光时刻PS Ⅱ 状态的详细信息。所有这些结合在一起，使MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ成为一款非常全面的荧光计，允许用户以多种不同的方式探测和监测PS Ⅱ和光合电子传递链。

重要升级

Ø  在多激发波长(PAM)配置中，用户可以测量与激发波长相关的有效PSⅡ天线尺寸信息：Sigma(Ⅱ)、PS Ⅱ受体侧的反应(QA-再氧化)和沿电子传递链的电子流(O-I1-I2-P/OJIP瞬变)，还可以进行饱和脉冲淬灭分析、诱导曲线和暗弛豫曲线， 以及光响应曲线，所有这些都适用于5种不同的激发和测量光波长(440、480、540、590、625 nm)以及可以任意组合应用的白光。这样做的好处是，例如，使用硅藻作为研究对象的人可以在绿色中激发这些生物，在蓝藻的情况下，可以选择625 nm来激发藻胆体或440 nm来激发核心天线的叶绿素。

Ø  MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ的高灵敏度允许使对薄的样品进行测量，即在没有光质和光强梯度的情况下测量样品，在很大程度上避免了波长依赖性的荧光重吸收。

Ø  使用滤光片自由选择检测波长，例如，能够检测荧光λ>700 nm，富含PSI荧光F(I)和λ< 710 nm，富含PSⅡ荧光F(Ⅱ)，可以在相同条件下同时测量。

Ø  通过比较PAM和闪光动力学(STK)测量来表征给定样品的相同状态。

Ø  创建Trigger和Script文件可以进行自定义实验程序测量，充分发挥用户自主设计实验的创造力。

应用概述：

配置选项：

1.       多激发波长配置：多波长激发单元(MCP-Ⅱ-E)及其检测单元(MCP-Ⅱ-D1或MCP-Ⅱ-D2ST)

2.       双波长检测(PAM)配置(悬浮液)：需两个检测器(MCP-Ⅱ-D1和 MCP-Ⅱ-D2ST)得以允许同时检测λ<710 nm(主要是PSⅡ)和λ>700 nm(PS Ⅱ+PS I)的荧光。允许两个波长检测的叶夹将在不久后推出。

3.       完整配置：STK闪光灯(最大闪光强度> 1.0 mol m-2 s-1)和组合检测器(MCP-Ⅱ-EDST+MCP-Ⅱ-D2ST)，允许检测低至约100 ns的信号，添加到多波长(PAM)配置中。这允许访问PSⅡ供体副反应。

4.       用于悬浮液测量的单翻转动力学(STK)配置：STK闪光灯(MCP-Ⅱ-EDST)与组合检测器(MCP-Ⅱ-D2ST)组合。

5.       用于叶片测量的单周转动力学(STK)配置：STK闪光灯作为独立应用：STK闪光灯包含一个用于从样品表面进行荧光测量的检测器，这使其成为测量树叶的理想选择。

PamWin-4 软件

基本功能和图形用户界面：PamWin-4是控制MULTI-COLOR-PAM(-II)和PAM-2500的软件，由PamWin-3发展而来，可以处理 MULTI-COLOR-PAM-II的所有新功能。该软件可在Windows 10（32位和64位）和11操作系统的个人电脑上运行。软件由3部分组成： SP分析、用于PAM应用的快速采集（前3个标签）和用于非调制闪光分析的单周转动力学 (STK)测量（后2个标签）。

广泛的应用组合也意味着可以在选项卡上定义大量特定应用的部分设置。在新的“ST设置"选项卡上，不仅可以定义单次、两次或多次闪光实验（如下图第一个示例），还可以定义用于确定周期-4 振荡的闪光序列（带或不带预闪），如下图第二个示例所示。

简单设置即可定义带或不带预闪的闪光实验和闪光序列。

用户可以通过一个简单的菜单定义单闪或双闪（或多闪）实验。后者对于配置泵浦探针测量尤为重要。通过脉冲系列菜单，可以定义闪光灯组。

将“目标编号"设为14，将应用14次闪光（在此情况下，间隔为200ms）。

通过两次预闪光（此处间隔100ms），可以诱导S3状态。通过改变预闪光和闪光组之间的延迟时间（此处为1秒），可以监测S3状态的衰减。

分析周期-4振荡的工具是软件的一部分（见应用）。

对于快速采集数据，软件提供两种支持。一方面是Trigger文件和Script形式的测量协议，另一方面是用于分析O-I1瞬变的拟合例程，以确定捕光天线横截面Sigma(Ⅱ)、单周转闪光后或照明一段时间后的指数荧光衰减。

软件附带的Script和Trigger文件也可用作示例，在此基础上开发其他脚本和触发器文件。

300 ms多相上升的Trigger文件，1ms后有一次单周转闪光。

在Trigger运行的情况下，Trigger文件中定义的实验协议将根据常规设置页面中的设置执行。

在Script文件的情况下，一个或多个触发文件被嵌入时间轴，同时定义实验不同部分的时间。在脚本中，用户还可以定义所用不同光源的强度和/或波长；这些设置可以根据脚本时间轴的进程进行更改。下面是一个Sigma(Ⅱ)测定的脚本文件示例，例如可以一次性测量五个不同激发波长的捕光天线截面。

应用实例

来自三个应用领域的示例实验

该软件将MULTI-COLOR-PAM-II的应用程序分为3个部分：

1.       光合活性相关的应用，如诱导曲线，诱导+暗弛豫曲线和光曲线自动程序，或手动测量。

2.       基于脚本的应用，如O-I1-I2-P/OJIP瞬变、单周转闪光后QA-的再氧化动力学、Sigma(II)测定。

3.       基于ST闪光的实验，如周期4振荡、类胡萝卜素三重态诱导和衰减动力学，P680+

前两部分代表PAM应用，最后一部分代表单周转动力学(STK)应用。

光曲线/淬灭分析

上图是测量PS II互补量子产率Y(II)+Y(NPQ)+Y(NO)=1的光曲线示例。由于记忆效应，光强减弱时诱导的动力学可能与光强增强时不同。这种现象被称为滞后。这里观察到的光诱导Y(II)降低和Y(NPQ)升高的wan quan可逆性是生理健康样品的特征。

测量快速动力学(PAM)

通过两个不同波长测量的O-I1-I2-P瞬变

PAM快相应用的一个例子是同时测量两个不同波长的O-I1-I2-P瞬变：在波长<710 nm处测得的荧光主要是PSⅡ荧光，而>700 n处的荧光则是PSⅡ和PSI荧光的混合荧光。该结果是由Klughammer等人(2024年)对小球藻细胞稀释悬浮液(440nm ML和MT)的测量shou ci发现的。

两种波长的O-I1上升(曲线归一化为I1)相同。I2和P之间存在差异：与F<710nm相比，在 F>700nm时，I2-P上升更明显。

下图是使用双波长叶片配置（请参阅“配置"），通过440 nm测量光和光化光测量大麦叶片的结果。

这两项测量结果再次归一化为I1(所有QA均已还原)。同样，与F<710nm相比，F>700nm处的I2-P上升更为明显。O-I1的上升动力学稍慢，这反映出 F<710nm波长处的自吸收比F>700nm波长处高，因此F>700nm波长处来自叶片相对较深的层，那里的有效辐射光强度较低。

功能性捕光截面Sigma(Ⅱ) 测量

参数Sigma(II)反映了PSⅡ捕光天线的有效截面。Sigma(Ⅱ)的测定（及其波长依赖性）是另一种PAM快速动力学测量的应用。有三个标准可以用来判断用于 Sigma(Ⅱ)测定的O-I1拟合是否良好：1. 拟合应能很好地描述荧光的上升；2. 得到的拟合参数应与生理相关；3. 获得的Sigma(Ⅱ)值应与光照强度无关。在这里，观察到Sigma(Ⅱ)值随着所用培养物的阶段而增加。

在这个实验中，连通性参数J被固定为1.2，这是Anne和Pierre Joliot在1964年获得的值。该数据集显示了近乎wan mei的拟合、合理的参数值，本质上是高光强度下光强度的独立性，产生了定义明确的 O-I1 动力学。

单周转闪动力学STK应用

类胡萝卜素三重态衰减

下图显示了一组测量值，根据这些测量值可以确定类胡萝卜素三重态衰变动力学。该数据集说明了闪光时间的精度，以及闪光灯提供两次相隔1μs的相同强度闪光的能力。

闪光长度和荧光诱导

另一个案例是双闪实验，其中第一次闪光的长度是变化的，第二次闪光是在第一次闪光40微秒后进行的。

闪光序列和闪光模式可以告诉我们一些有关S态的信息，即供体侧锰簇的氧化还原态。它们还能告诉我们不同强度的远红外光的影响。

周期-4 振荡

软件可自动得出 Fo、Fm 或 Fv水平的周期-4 振荡(图摘自Klughammer等人，2024年)。

在咖啡叶片中，FR1照明已导致可变荧光中的周期-4 振荡受到强烈抑制。在这种情况下，MULTI-COLOR-PAM-II可以将有效的FR强度进一步降低到FR1的10%，这就大大降低了对咖啡叶S态的影响。

STK和 PAM组合测量

下一个案例展示了如何通过STK和PAM测量光的组合，将精确、高强度和短时间的STK和PAM测量光结合起来，以监测黑暗中的荧光衰减。

在PAM测量中，对受DCMU抑制(蓝色)或未受抑制(红色)的稀释小球藻样本施加3 µs STK闪光。从闪光后100 µs开始，ML频率从100 kHz对数下降到10 kHz（图摘自Klughammer等人，2024年）。

产地：德国WALZ

参考文献(MULTI-COLOR-PAM-II)

1.       Klughammer, C., Schlosser, F. & Schreiber, U. Flash-kinetics as a complementary analytical tool in PAM fluorimetry. Photosynth Res 161, 151–176 (2024). 

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